As aplicações práticas do eDNA (DNA ambiental) estão em crescimento exponencial, especialmente para a avaliação e monitoramento de ambientes aquáticos, sendo bastante utilizada para levantamento ecológico de espécies presentes em corpos hídricos (Coster et al., 2021; Sanchez et al., 2022; Thomsen; Willerslev, 2015; Valentini et al., 2016). Como a amostragem e análise de eDNA não é invasiva, melhora a detecção das espécies-alvo sem ocasionar estresse nos animais (Thomsen; Willerslev, 2015). Esta técnica tem grande potencial para aplicação na estimativa de animais aquáticos de produção, pois nas fazendas de produção de peixes ou camarões a quantificação dos animais é realizada por amostragem ou por estimativa do consumo de ração que, particularmente nas grandes propriedades, se mostra bastante laboriosa, lenta e imprecisa devido à grande extensão territorial e quantidade de tanques de criação presentes (Li, D.; Hao; Duan, 2020). O eDNA também apresenta potencial para identificação de espécies de pragas invasoras, mesmo quando em baixas densidades, em qualquer fase da vida, mostrando-se promissora para utilizar ao longo de todo o período de cultivo (Coster et al., 2021; King et al., 2022). A detecção precoce de espécies invasoras é fundamental para a implementação de estratégias de manejo para limitar os impactos nocivos dessas espécies (Thomas et al., 2020).

As análises de eDNA detectam a presença de uma espécie a partir de vestígios que o organismo deixa no meio ambiente na forma de células excretadas, excrementos ou matéria em decomposição e possibilita identificar espécies-alvo, ou até mesmo a composição de uma comunidade inteira em larga escala, por meio de DNA metabarcoding (Muha et al., 2019). Nesta técnica, o DNA genômico extraído de amostras ambientais, como água ou solo, é utilizado para a amplificação de genes- -alvo utilizando primers específicos, os quais são sequenciados com tecnologias de sequenciamento de alto desempenho (Hänfling et al., 2016). Atualmente, o setor da aquicultura tem buscado metodologias mais precisas para quantificação dos animais nos tanques de criação ao longo do ciclo produtivo, pois compreende que a maior precisão destas estimativas é vital para realização de uma criação mais produtiva e sustentável, uma vez que constituem a base para determinar o montante de ração a ser ofertado ao longo do ciclo de produção, evitando assim desperdícios e a contaminação dos corpos d’água adjacentes com efluentes contendo alta carga orgânica e aumentando a eficiência produtiva (Herath; Satoh, 2022; Li, D.; Hao; Duan, 2020). Adicionalmente, é determinante na tomada de decisões em relação ao manejo, à programação das despescas, às medidas sanitárias frente a enfermidades, e entre outros. Por esses motivos, o presente estudo buscou avaliar a eficiência da técnica de metabarcoding de eDNA em identificar e quantificar material vestigial de camarão nos tanques de cultivo.

Material e métodos

 O trabalho foi desenvolvido e executado no Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Catarinense - Campus Araquari, Brasil. Para a análise de quantificação de camarões marinhos em água clara foi utilizada a água de seis tanques experimentais de 500 L povoados com camarões da espécie Litopenaeus vannamei. Três tanques foram povoados com um animal de ±13g cada (N1A, N1B e N1C) com densidade final de 2 camarões/ m3 . Outros três tanques foram povoados com 10 animais de ±13g cada (N10A, N10B e N10C) com densidade final de 20 camarões/m3 . Para análise de eDNA foram coletadas amostras de 1L de água de cada tanque, aproximadamente 10 cm abaixo da superfície e 15 dias após o povoamento dos animais. Para minimizar o risco de contaminação cruzada, foram utilizadas luvas nitrílicas descartáveis e materiais de coleta estéreis e livres de RNAse, DNAse e pirogênios (Sato et al., 2018). O ensaio de detecção de DNA de crustáceos foi desenvolvido para a identificação de crustáceos da ordem Decapoda, que compreendem os exemplares comerciais do subfilo Crustacea. Dentre os alvos estão camarões, caranguejos, siris e lagostas. O DNA extraído foi encaminhado para o preparo de biblioteca, sendo este realizado em duas etapas de PCR. O Food Defense - DNA Crustáceo foi realizado em sequenciamento do tipo paired-end, com cobertura de 10.000 reads, utilizando o sequenciador MiSeq, da plataforma Illumina. Os dados foram então submetidos a análises de Bioinformática para posterior interpretação.

Resultados e discussão

Foi possível identificar sequências de eDNA de camarão nas amostras coletadas, e todas correspondiam à espécie Litopenaeus vannamei. Conforme pode ser observado na Figura 1, no tanque N10A foi encontrado 30.765 sequências e no tanque N10C foi encontrado 20.570 sequências (25.667,5 ± 7.208,9: média ± desvio padrão). Devido à um erro no processamento não foi possível analisar a amostra do tanque N10B. Já no tanque N1A foi encontrado 6.586 sequências, no tanque N1B 3.642 sequências e no Tanque N1C 2.915 sequências (4.381,0 ± 1.943,9: média ± desvio padrão). Em termos médios houve um incremento de 6 vezes na quantidade de sequências detectadas em decorrência do aumento de 10 vezes na densidade de animais nos tanques. Deste modo, foi possível estabelecer uma relação da quantidade de animais e a abundância de eDNA, visto que nos tanques com maior densidade de estocagem o número de sequências encontradas foi maior em relação aos de menor densidade.

Uma vez liberado dos organismos, o DNA extracelular no meio ambiente pode persistir, adsorvido em partículas orgânicas ou inorgânicas, mas também pode ser transformado por microrganismos competentes do solo ou pode ser degradado (Parsons et al., 2018). Vários fatores atuam na degradação do DNA, como nucleases endógenas, água, radiação ultravioleta e a ação de bactérias e fungos no meio ambiente contribuem para a decomposição do DNA (Buxton et al., 2017; Harper et al., 2019; Stewart, 2019). O metabarcoding de eDNA oferece um método potencial para identificar espécies presentes no cultivo precocemente e implementar planos de manejo, mesmo no estágio larval, identificando pragas que podem afetar negativamente a carcinicultura como moluscos, peixes e outros crustáceos (Karlsson et al., 2022; Laporte et al., 2022; Valentini et al., 2016). É extremamente sensível, capaz de detectar DNA em concentrações de 0,02% da biomassa total analisada, além de detectar uma variedade de táxons simultaneamente, podendo ser aplicado tanto em ambientes de água doce quanto marinhos (Hatzenbuhler et al., 2017; Thomsen; Willerslev, 2015).

Conclusão

A amplificação por PCR do eDNA presente nas amostras de água confirmou a eficiência dos primers e desta metodologia em detectar eDNA de camarão em tanques de criação. Foi possível identificar a taxonomia dos animais à nível de espécie. Nossos resultados mostram um grande potencial para a identificação e quantificação de espécies aquáticas. Estudos futuros são necessários para determinar a relação da densidade com a quantidade de sequências encontradas nas amostras, definir os protocolos de bioinformática e a interpretação dos dados a serem utilizados. Além de realizar a experimentação em diferentes condições de cultivo e variáveis ambientais, com uma maior quantidade de repetições, com e sem renovação de água, com e sem alta carga orgânica, diferentes temperaturas, cultivo com mais de uma espécie e tempo de cultivo, de modo a corroborar a relação obtida no presente estudo entre a quantidade de sequências de eDNA com a densidade de estocagem.

Autores: Pedro Henrique Sousa Ferro1,2; Beatris Rosalinda Michels1,2; Maria Eduarda de Sousa Henriques1 ; Sabrina Dolzan1 ; Teddy de Souza Paranhos3 ; Rafael Rodrigues de Oliveira3 ; Wellington Pine Omori3, Adolfo Jatobá1,2 e Delano Dias Schleder1,2 A

1 Laboratório de Aquicultura Instituto Federal Catarinense - IFC Campus Araquari, SC *e-mail correspondência; 2 Mestrado Profissional em Produção e Sanidade Animal Instituto Federal Catarinense - IFC Campus Araquari, SC; 3 Neoprospecta Florianópolis, SC

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