No quarto artigo (edição nº 14, set/out 2018), foi demonstrado como as bactérias heterotróficas atuam na remoção de amônia em cultivos aquícolas, via síntese do biopolímeros PHA (polihidroxialcanoato) e como é possível cultivar o bioflocos usando produtos básicos seja da agricultura, ou mesmo de uma simples farmácia. O presente artigo buscará demonstrar como controlamos o nitrito de forma direta e eficiente no sistema BRASYS (Biofloc, RAS and Aquaponics System), trabalhando em simbiose com as bactérias heterotróficas do meio.

Nitrificação: um breve histórico

O lançamento de águas residuárias contendo compostos nitrogenados tem um importante impacto sobre a saúde e o meio ambiente. O nitrogênio é um dos contaminantes mais importantes presentes nas águas residuais. Historicamente, o processo de nitrificação é um tema muito estudado, pela sua fundamental importância no processo de produção agrícola e tratamento de água para o consumo humano. O botânico Emil Godlewski (Cracóvia, Polônia), no final do século XIX, se dedicou ao estudo da nitrificação aplicado no crescimento das plantas (Godlewski, 1892) e na nitrificação da amônia e fontes de carbono utilizadas (Godlewski, 1895). Howard Lees (University of Aberdeen, Escócia), em duas publicações na Nature, em 1948 e 1952, demonstrou, cultivando as bactérias Nitrosomonas, como a hidroxilamina é o composto intermediário na oxidação da amônia. Tais trabalhos deram suporte para Knowles e colaboradores (1965), em Stevenage (Reino Unido), determinassem as cinéticas de crescimento das bactérias nitrificantes: Nitrosomonas e Nitrobacters. Com isso, diversos autores estudaram o mecanismo de nitrificação aplicado no tratamento de águas residuais em sistemas de lodo ativo e biorreatores aeróbicos e anaeróbicos (Molina & Rovira, 1964; Hoopey & Nason, 1965; Wallace & Nicholas, 1968; Hulth et al., 2005; Antileo et al., 2006).

Entendendo a rota metabólica da nitrificação

Estudos biogeoquímicos permitiram aplicar alternativas tecnológicas mais práticas para o tratamento biológico do nitrogênio. Basicamente, este tratamento se dá em dois processos, a nitrificação e a desnitrificação (Philips, 2008). Na fase da nitrificação, em condições aeróbicas, o amônio é oxidado em duas etapas: na primeira, é levado até nitrito pelas bactérias oxidadoras de amônio (BOA), lideradas pelas Nitrosomonas sp., e numa etapa subsequente o nitrito é consumido pelas bactérias oxidadoras de nitrito (BON), como as Nitrobacter sp., tendo como principal produto o nitrato. Sob condições de baixa saturação de oxigênio ou mesmo anóxicas, o amônio oxidado é então convertido por bactérias heterotróficas em nitrogênio gasoso e síntese de PHA (polihidroxialcanoatos) (Chang et al., 2011; Munoz et al., 2009), como relatamos no artigo anterior desta série.

A demanda de oxigênio para a nitrificação é aproximadamente a metade da demanda para oxidação do material orgânico. O consumo de alcalinidade que acompanha a nitrificação pode reduzir o pH a valores tais que inviabilizem processos biológicos e aumentando a acidez no sistema de tratamento. Downing et al. (1964) estabeleceram que os dois passos da nitrificação podem ser descritos pela cinética de Monod, típico para processos biológicos. Mostraram que a cinética da nitrificação depende de uma variável operacional (tempo de maturação biológica do corpo d’água) e de três constantes: a) taxa de crescimento máximo de Nitrosomonas e Nitrobacter, b) constante de decaimento destas bactérias e c) a constante de meia saturação. Van Haandel e Marais (1999) mostraram que na cinética de Monod a constante mais importante é a taxa máxima de crescimento de Nitrosomonas ou Nitrobacter, não somente porque esta constante tem muito mais influência sobre a taxa de nitrificação que as outras constantes, mas também porque se mostra muito mais influenciada pela composição e origem da água residuária.

A oxidação de amônio pelas BOA e a oxidação de nitrito pelas BON são processos independentes, porém, competem entre si quanto a disponibilidade de oxigênio e carbono inorgânico. Esse grupo de bactérias se caracteriza por obter sua energia para crescer da oxidação de compostos inorgânicos (NH4 +) e (NO2 - ), utilizar o carbono inorgânico (CO2 ) como fonte de carbono e o oxigênio (O2 ) como aceptor de elétrons. Adicionalmente, a velocidade de crescimento bacteriano (μ) e constante de saturação por oxigênio (K), entre estes dois grupos de bactérias são diferentes, indicando um intervalo na sequência de reações bioquímicas. As BOA possuem μ de 0,77d-1 e K de 0,3mg O2 .L-1, e as NOBs com 1,08d-1 e K de 1,1mg O2 .L-1.

As BOA e BON são autotróficas, o que as caracterizam por ter velocidades de crescimento (μ) muito baixas em comparação com as bactérias heterotróficas, (0,77 e 7,20d-1, respectivamente) (Cox, 2009). O processo de nitrificação é limitado pela concentração de oxigênio e temperatura, bem como inibido pela concentração de amônia e carbono orgânico. Por conta destes inúmeros relatos, há o acúmulo de nitrito no tanque de cultivo. A intoxicação pelo nitrito inibe de forma irreversível a absorção de oxigênio pelas proteínas transportadoras de oxigênio nos animais cultivados. Nos peixes, este evento é denominado metaglobinemia, no qual, a hemoglobina é convertida em metaglobina. Tal situação é muito mais severa em animais cultivados em baixa salinidade, pois a presença de íons de cloro (Cl- ) na água salgada, inibe a ligação de nitrito as proteínas transportadoras de oxigênio (hemoglobina em peixes e hemocianina em camarões).

A equação estequiométrica do processo de nitrificação, segundo (Ebeling et al., 2006), consiste em: NH4 + + 1,83O2 + 1,97 HCO3 - ----> 0,024C5 H7 O2 N + 0,976 NO3 - + 2,9 H2 O + 1,86CO2 . Convertendo mols para massa em gramas, para cada 1g de nitrogênio-amoniacal oxidado, são necessários 7,05g de alcalinidade (bi/carbonatos) e 4,18g de oxigênio. Assim, são produzidos 0,2g de biomassa bacteriana, 5,85g de gás carbônico e 0,98g de nitrogênio-NO3 (Tabela I). Porém, como produto intermediário temos o Nitrito (NO2 ). Desta forma, é possível observar que não há produção de matéria orgânica significante no processo de nitrificação, e que a oferta de carbono orgânico, juntamente com o oxigênio são os fatores limitantes do processo.

Nitrosomonas: a vilã da nitrificação

O acúmulo de substâncias tóxicas inorgânicas, como amônia e nitrito, é um dos principais problemas de qualidade da água em sistemas aquícolas intensivos. O nitrito é um importante produto intermediário no processo de nitrificação. Dependendo das concentrações e do estágio de desenvolvimento do organismo aquático cultivado, pode vir a ser bastante tóxico, causando mortalidade em larviculturas e sistemas de cultivo (Barbieri et al., 2014). O mecanismo tóxico do nitrito atua sobre o transporte de oxigênio, no qual o nitrito se liga à hemocianina (proteína de transporte de oxigênio em crustáceos), ocupando o lugar do oxigênio, transformando-a em metahemocianina, a qual é incapaz de transferir oxigênio para os tecidos. Dessa forma, ocorre uma redução na quantidade de oxigênio disponível para o metabolismo e um aumento da pressão parcial do oxigênio (pO2 ), podendo ocorrer hipóxia e, consequentemente, morte dos camarões por ausência total de oxigênio (anóxia). Nas tilápias, a resistência a toxicidade do nitrito é um pouco maior, porém, quando presente em altas concentrações também pode levar a mortalidade em massa no tanque de cultivo.

A presença de nitrito no cultivo estava diretamente relacionada a presença de bactérias do grupo das Nitrosomonas e a de amônia. Com estes dois componentes, a síntese de nitrito é inevitável. A concentração letal média (CL50) é a concentração estimada que produz mortalidade em 50% da população-alvo, em um período de tempo específico, geralmente de 24 a 96 horas. Campos et al. (2012) relataram, utilizando juvenis de Farfantepenaus brasiliensis (camarão-rosa), em salinidade de 28ppt, 25ºC e pH de 8,29, obtiveram as CL50 (96h) de amônia e nitrito de 20 e 40mg.L-1, respectivamente. Frías-Espericueta et al. (1999), testando L. vannamei (camarão- -cinza), obteve CL50 (96h) para amônia de 70,9mg.L-1.

Como praticamente todas as bactérias nitrificantes comercialmente disponíveis contém os dois grupos de bactérias, BOA e BON, usar estas bactérias em um tanque de cultivo intensivo com amônia elevada era inevitável a perda de animais, pela proliferação de Nitrosomonas e o acúmulo de nitrito na água. Por três vezes, perdemos toda a nossa produção de camarões, seguindo a orientação da assessoria contratada, de inocular diretamente estas bactérias comerciais e adicionando carbono orgânico para auxiliar na proliferação das bactérias heterotróficas. Tudo ao mesmo tempo! Em poucos dias não restavam animais no tanque de cultivo, pois o nitrito acumulou-se por um longo período. As Nitrosomonas tornaram-se a nossa principal vilã.

O Biorreator de Nitrobacters: a solução

A perda de produção em tanques intensivos fez com que buscássemos outras estratégias, mais precisas e rápidas, para combater as altas concentrações de nitrogenados na água do cultivo, tanto para o tratamento da amônia, quanto para o nitrito. A amônia quando dissolvida na água encontra-se em equilíbrio entre as formas ionizada e não ionizada (tóxica), sendo este equilíbrio influenciado pelo pH, temperatura e salinidade. Alterações destes parâmetros resultam na variação da concentração das diversas formas de nitrogênio, que podem atingir concentrações tóxicas para os peixes e camarões. A forma não ionizada da amônia, difunde-se facilmente através das membranas respiratórias, causando danos ao epitélio branquial e, como consequência, dificulta as trocas gasosas entre o animal e a água, desestabilizando o sistema de osmorregulação. O nitrito em altas concentrações provoca um quadro de cianose, tornando-se letal aos animais em pouco tempo.

Desta forma, para que pudéssemos antecipar os picos de amônia e nitrito, criamos um biorreator simples (Figura 1), de duas fases, específico para cada problema a ser enfrentado: amônia e nitrito. A primeira fase consiste em reduzir as altas concentrações de amônia na água do cultivo, ativando as bactérias heterotróficas dos probióticos comerciais a base de Bacillus cereus e B. subtilis utilizando fontes de carbono orgânico, com uma maior concentração de carboidratos, como açúcar mascavo, acompanhando com o medidor de ORP (do inglês: Oxidation Reduction Potencial). Valores de ORP acima de +110mV indicam um processo químico de oxidação ocorrendo na água do biorreator, o que caracteriza a ativação das bactérias que normalmente são vendidas no estágio de quiescência. Esta ativação foi fundamental para controlarmos o nível de amônia na água do cultivo. Com o crescimento exponencial bacteriano após a ativação pelo biorreator, conseguimos zerar os níveis de amônia em menos de 48h, partindo de 13,5ppm.

Com isso, eliminamos o substrato para a ação das BOA presentes no cultivo. Neste cenário, estávamos inibindo a ação das Nitrosomonas por competição pelas bactérias heterotróficas, que convertiam toda a amônia em PHA, não restando amônia para as Nitrosomonas oxidarem amônia em nitrito. Isso graças a velocidade de crescimento bacteriano específico (μmax) das bactérias heterotróficas serem 9,3x maior do que o μmax das BOA.

Altas concentrações de amônia inibem a ação das BON, com isso, iniciamos a segunda fase do processo, que consistia em tratar o nitrito da água, inoculando mais bactérias comerciais que continham Nitrobacters, porém, em condições físico-químicas favoráveis, como o oxigênio, apenas para as BON que oxidaram o nitrito residual em nitrato. Nossos dados indicaram que a velocidade de oxidação de nitrito a nitrato (descida da concentração do nitrito: A=-3,5d+18,7, r²=0,97) foi maior do que a velocidade da oxidação da amônia em nitrito (subida da concentração de nitrito: N=2,9d-3,7, r²=0,93), pelas BON do tanque de cultivo (Figura 2), demonstrando a eficiência catalítica das BON após a retirada da amônia da água do cultivo pelas bactérias heterotróficas cultivadas no biorreator.

Conclusão

Concluímos que, como a amônia é tóxica e inibe a atividade das bactérias nitrificantes, esta inibição ocorre de forma desigual para os dois grupos de microrganismos (BOA e BON) envolvidos no processo, com tempos de oxidação da amônia e do nitrito diferentes. As BOA são mais resistentes à amônia livre que as BON por possuírem a própria amônia como substrato metabólico. A amônia não ionizada é inibidora das BON a uma concentração de 0,1 a 1,0mg.L-1, enquanto a inibição das BOA ocorre a uma concentração de 10 a 150mg.L-1. Carboidratos em excesso na água do cultivo podem inibir a ação de ambas. Os bi/carbonatos precisam estar sempre elevados (>120 mg.L-1) para fornecer energia para as BOA e BON. As heterotróficas são mais eficazes e mais ágeis na redução de amônia nos tanques de cultivo, quando comparadas as BOA. Esta estratégia, quando realizada via biorreator, faz com que não haja mais substrato (amônia) para as BOA sintetizarem nitrito, criando um ambiente favorável para a ação das BON. Ao eliminar a amônia, pela síntese de PHA pelas bactérias heterotróficas, e oxidando o nitrito residual com bactérias Nitrobacters, cultivadas em biorreator específico, pode-se controlar os níveis de nitrogenados em cultivos superintensivos, diminuindo a mortalidade e aumentando a produtividade.

Autor|:

Raimundo Lima da Silva Junior

Biomédico, Mestre em Biologia Núcleo de Pesquisas Replicon,

Escola de Ciências Agrárias e Biológicas

Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC,GO)

Presidente e Sócio Fundador da Cooperativa de Pesca e Aquicultura de Goiás (COOPAQ)

railim.jr@gmail.com

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