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A imunohistoquímica como ferramenta diagnóstica de enfermidade nos peixes

A imunohistoquímica como ferramenta diagnóstica de enfermidade nos peixes
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Como resultado do crescimento da aquicultura semi-intensiva e intensiva, os problemas derivados de enfermidades, naturais ou originárias de cultivo, têm se tornado um dos maiores limitantes ao desenvolvimento sustentável da criação de organismos aquáticos.

Nos últimos anos tem havido diversas iniciativas no campo da patologia dos organismos aquáticos, entretanto, o conhecimento destas enfermidades e o tratamento para combatê-las se encontram em níveis muito diferentes em cada País, bem como o desenvolvimento de ferramentas aplicadas ao seu controle. De forma geral, as técnicas empregadas na patologia de organismos aquáticos têm herdado grande parte do conhecimento e da tecnologia usada na medicina humana e veterinária.

Neste contexto, a imunohistoquímica é um ramo da histologia que tem como objetivo a detecção de antígenos em cortes de tecidos processados, através de técnicas de rotina, sendo de grande utilidade como método diagnóstico.

As técnicas imunohistoquímicas são eficazes como ferramentas para o reconhecimento e posterior caracterização de anticorpos monoclonais (AcMc). Por meio destas técnicas pode-se visualizar uma reação antígeno/ anticorpo específica em uma célula e/ou um tecido, tanto com microscopia óptica como eletrônica.

A técnica se baseia em aplicar sob o tecido ou amostra em estudo, o anticorpo contra o antígeno que se deseja detectar. Posteriormente, este anticorpo específico é utilizado como antígeno e marcado com um segundo anticorpo inespecífico, o qual será ligado a um sistema molecular que pode ser detectado por uma técnica de coloração. Neste momento, o exame microscópico do corte histológico nos permite determinar a presença ou ausência do antígeno que buscamos e, em caso positivo, podemos ver em que lugar exato do tecido ou de células ele se encontra alojado.

 

 

Histórico da imunohistoquímica

A técnica de imunohistoquímica surgiu pela primeira vez em um diagnóstico histopatológico por volta dos anos 70, e logo sofreu uma enorme expansão a partir da descoberta e aplicação dos anticorpos monoclonais, os quais agregaram precisão e especificidade à metodologia, sendo sintetizados centenas de anticorpos desde então, muitos dos quais possuem grande utilidade no diagnóstico das enfermidades de organismos aquáticos.

Os AcMc são obtidos a partir da produção de hibridomas, cujas células sintetizam um tipo especial e invariável de AcMc. Embora seja possível utilizar anticorpos policlonais, os AcMc fornecem um diagnóstico de maior especificidade. A razão desta especificidade é que o AcMc reconhece somente um epítopo (determinante antigênico) semelhante ao da molécula que foi utilizada para sua produção, o que significa dizer que é gerado um hibridoma para produzir AcMc específicos contra determinados epítopos de vírus, bactérias e parasitos.

 

Como fazer uma análise imunohistoquímica?

Para se realizar uma técnica de imunohistoquímica é necessário:

  • Um AcMc específico contra o epítopo que desejamos detectar;
  • Um segundo anticorpo relacionado ao AcMc;
  • Enzimas;
  • Substratos;
  • Cromógenos.

As enzimas são catalisadores proteicos eficientes e sensíveis. Somente uma molécula de determinada enzima pode catalisar e, consequentemente, transformar entre 10.000 e 100.00 moléculas de substrato por minuto. As enzimas podem ser classificadas (muito superficialmente) em enzimas hidrolíticas (esterase, protease), fosforilases, enzimas oxidoredutoras (desidrogenases, oxidases, peroxidases, enzimas de transferências, descarboxilases e outras).

A atividade enzimática depende de algumas variáveis, como a concentração de enzima e substrato, pH, concentração de sais, temperatura e luz. Muitas enzimas possuem porções terminais não proteicas denominadas grupos prostéticos, exemplo destes podemos citar o grupo Fe-protoporfirina da peroxidase e CO2 transferase da biotina. Por fim, cabe mencionar também que muitas enzimas exigem a presença de metais ou certos íons para atuar (Mg e Zn).

A pergunta chave: Para que serve a imunohistoquímica?

As aplicações da imunohistoquímica são incontáveis. Qualquer antígeno é demonstrável sempre que se dispõe do anticorpo correspondente, e hoje em dia existe uma lista enorme de anticorpos. Os protocolos de investigação incluem a busca de substâncias das mais variadas e incalculáveis. Dessa forma, pode-se fazer uma breve lista com as aplicações mais frequentes na patologia de peixes.

Expressão de proteínas normais

O estudo da expressão fenotípica de proteínas normais é de utilidade em certas patologias onde a síntese de tais proteínas é modificada (Figuras 1, 2 e 3).

 

Diagnóstico de enfermidades virais

O número de vírus isolados em peixes tem aumentado nos últimos anos. Estes patógenos podem ter grande impacto econômico no setor produtivo. Com a imunohistoquímica, é possível fazer um diagnóstico de precisão de algumas destas enfermidades (Figuras 4).

 

Diagnóstico de enfermidades bacterianas

As bactérias representam uma das noxas biológicas que mais frequentemente produzem enfermidades nos peixes, sendo responsáveis por altas mortalidades em peixes silvestres ou cultivados, infectados por estes microrganismos. Embora os métodos clássicos de bacteriologia continuem sendo bastante utilizados, os anticorpos monoclonais são de grande utilidade na hora de estabelecer que bactéria esteja gerando uma determinada enfermidade, como também sua presença com precisão no tecido atingido (Figuras 5 e 6).

 

Diagnóstico de enfermidades neoplásicas

Os peixes teleósteos, igualmente a outros vertebrados, são susceptíveis a desenvolver neoplasias. Como outras enfermidades de peixes que já são bem estudadas, já se tem descrito uma grande variedade de neoplasias, tanto benignas como malignas, originadas de uma grande variedade de tecidos. Estas lesões ocorrem tanto em peixes teleósteos marinhos como em dulciaquícolas.

A potenciabilidade de alguns produtos industriais para induzir tumores (alguns detergentes, clorometileno, hidrocarbonetos aromáticos e clorados, entre outros), é bem conhecida. Por lado, a cada dia surge um maior interesse no desenvolvimento experimental de neoplasias em peixes. Os modelos experimentais nos dão a possibilidade de conhecer desde novos carcinógenos, fundamentalmente ambientais, até revelar os mecanismos íntimos moleculares da carcinogênese. A imunohistoquímica permite estabelecer a histogênese de uma neoplasia e sua correta classificação (Figuras 7 e 8).

 

Conclusões

A técnica de imunohistoquímica representa uma ferramenta de alta especificidade, custo aceitável e resultados rápidos, sendo demonstrada como um ótimo método a ser utilizado no diagnóstico de enfermidades em peixes e organismos aquáticos em geral, o que dentro da aquicultura vem a ser um importante aliado no monitoramento sanitário dos animais.

 

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Autores:

Luis Alberto Romano* Virgínia Fonseca Pedrosa

Laboratório de Imunologia e Patologia de Organismos Aquáticos Instituto de Oceanografia Universidade Federal do Rio Grande – FURG – Rio Grande, RS

*dcluis@yahoo.com