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Engenharia genética em probioticos nativos

Engenharia genética em probioticos nativos
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Uma potencial aplicação no controle das viroses que afetam a carcinicultura

MSc. João Costa Filho &
Dr. Luis Fernando Marins
Programa de Pós-Graduação em Aquicultura,
Universidade Federal de Rio Grande – FURG. Rio Grande – RS.
costafilhojoao@gmail.com
dqmluf@furg.br

Introdução

O cultivo de organismos aquáticos tem apresentado um crescimento nos últimos anos, sobretudo em relação ao camarão Litopenaeus vannamei. No entanto, a ocorrência de enfermidades, principalmente de etiologia viral, tem afetado significativamente a produção mundial, especialmente na Ásia e América Latina. A ocorrência de doenças infecciosas e seus reflexos econômicos têm sido o principal desafio para a carcinicultura mundial. Especialmente no Brasil, duas principais viroses vêm promovendo constantes prejuízos: o Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV) e o Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV). Desta forma, é necessário o desenvolvimento de pesquisas que promovam ações imediatas para diminuir os problemas sanitários observados na carcinicultura.

 

Silenciamento gênico

Os camarões possuem sistema imune inato com ausência de resposta adaptativa. Esse fato inviabiliza a tentativa de produção de vacinas para combater as enfermidades, principalmente de etiologia viral. Contudo, a descoberta do mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional ou RNA de interferência (RNAi) tem gerado uma nova perspectiva para o tratamento de doenças virais nos camarões. Essa tecnologia é uma ferramenta capaz de silenciar a expressão gênica e replicação viral, onde fitas duplas de RNA (dsRNA) conduzem a degradação do RNA mensageiro (RNAm) homólogo a mesma sequência. No camarão L. vannamei o mecanismo de RNAi já foi induzido com a injeção intramuscular de dsRNA relacionadas com sequências específicas dos vírus da IMNV e WSSV, apresentando boas respostas na limitação da infecção viral e sobrevivência dos camarões, tornando o mecanismo RNAi um importante método de intervenção terapêutica aplicado a carcinicultura.

 

Engenharia genética no combate às enfermidades virais

No entanto, a utilização dessa tecnologia em larga escala no cultivo dos camarões está limitada pela quantidade de moléculas de dsRNA a serem sintetizadas, o alto custo de produção, bem como a forma de aplicação, que seria por injeção individual nos camarões. Tem sido demonstrado que é possível a produção de dsRNA através da engenharia genética em bactérias como a Escherichia coli, porém a forma de aplicação no cultivo ainda necessita ser avaliada. Na literatura, já foi demonstrado que cepas probióticas de Bacillus recombinantes podem ser utilizadas via dieta como um “veículo vacinal” para camarões desafiados com agentes virais. Desta forma, a engenharia genética aplicada em Bacillus ou bactérias com potencial probiótico (Figura 1), pode representar uma importante ferramenta no tratamento de viroses que afetam a carcinicultura.


Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura dos probióticos nativos do gênero Bacillus, isolados do trato intestinal de crustáceos e utilizados como modelo de estudo para aplicação da engenharia genética.

Os avanços da FURG

O grupo de pesquisa vinculado ao Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da FURG, liderado pelo Prof. Dr. Luis Fernando Marins e o doutorando MSc. João Costa Filho (Figura 2), do Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da FURG, vem desenvolvendo a engenharia genética em cepas nativas de Bacillus para produção de dsRNA que possam ativar o mecanismo do RNAi e combater viroses como o WSSV e o IMNV. Até o presente momento, esse trabalho conta com a parceria de grupos de pesquisa de três Universidades Federais: Universidade Federal do Ceará (UFC), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) e Universidade Federal de Pelotas (UFPel), bem como concessão de auxílio financeiro do CNPq no âmbito do Edital Universal 2014.


Figura 2. Principais pesquisadores relacionados com o trabalho de engenharia genética em Bacillus. Prof. Dr. Luis Fernando Marins (esquerda), líder do grupo de pesquisa vinculado ao Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da FURG. MSc. João Costa Filho (direita), doutorando do Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da FURG.

Com o andamento do trabalho foram obtidos alguns resultados que estão em processo de publicação. Foi realizada a engenharia genética de sete cepas nativas de Bacillus para expressão da proteína verde fluorescente – gfpmut1 (Figura 3) e utilização de umas dessas cepas fluorescentes via ração no cultivo experimental do camarão L. vannamei, avaliando sua permanência no trato intestinal e potencial probiótico. Nesse mesmo sentido, foi concluído o sequenciamento genômico de três cepas nativas de Bacillus sp., realizado na UFPel. Essa etapa é de fundamental importância para o conhecimento da diversidade molecular das cepas e criação de estratégias aplicáveis para as técnicas de engenharia genética.


Figura 3. Microscopia de epifluorescência com aumento de 1000 x em contraste com a luz branca e azul, para observação da expressão da proteína fluorescente verde – gfpmut1. As imagens A e A1 demonstram o Bacillus original como controle, sem expressão. Em B e B1 está demonstrado o Bacillus – gfpmut1 manipulado. Escala da barra de 10 µm, para todas as imagens. FONTE: O autor (2016).

Além disso, foi aplicada engenharia genética na cepa nativa Bacillus #39 para promover a produção das dsRNA. Cabe ressaltar que o gene rnc, presente no genoma dos Bacillus, é responsável pela produção da enzima ribonuclease III, que atua na degradação de dsRNA. Contudo, a cepa Bacillus #39 praticamente não apresentou degradação dessas moléculas, ou seja, existe uma baixa atividade dessa enzima. Adicionalmente, foi transformada para expressão episomal de dsRNA a cepa de Escherichia coli HT115 (possui o gene rnc deletado). Esses dois últimos modelos estão em fase de pré-testes na UFC, onde está sendo avaliada a capacidade de ativação do mecanismo RNAi no L. vannamei, pelas dsRNA produzidas. Posteriormente será realizado um novo experimento com desafio viral e avaliação da sobrevivência dos camarões. De modo geral, se for possível a obtenção de bons resultados de sobrevivência, poderemos confirmar que nosso grupo de pesquisa foi capaz de criar microrganismos recombinantes que produzem dsRNA e podem ser utilizados nos sistemas de cultivo dos camarões.

 

Perspectivas futuras

Dessa forma, estamos trabalhando na criação de um método viável de produção e fornecimento das dsRNA que possa ser aplicado no cultivo comercial do camarão. Esse fato pode representar um incremento tecnológico para a carcinicultura relacionado com o tratamento antiviral. Para complementar nosso trabalho criamos uma parceria de pesquisa no Institut für Industrielle Genetik – Universität Stuttgart (Alemanha), onde pretendemos no próximo ano (2018) utilizar a técnica CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para edição genômica no B. subtilis. Esse trabalho terá como propósito a deleção do gene rnc e produção de dsRNA, para ativação do mecanismo do RNAi, utilizando uma recente e inovadora técnica de biologia molecular, complementando os resultados já obtidos. Pretendemos buscar aprofundamento teórico e conhecimento no exterior para, além da produção científica nesse período, uma provável aplicação futura em pesquisas que podem ser desenvolvidas no Brasil em parceria com outras Universidades.

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